精制禽流感高免卵黄抗体的研究
www.xbxmw.com 2008-4-15 22:40:44 来源： 阅读：次
1 材料与方法
1.1 疫苗 禽流感油乳剂灭活苗，中牧股份实业有限公司郑州生药厂，批号030444。
1.2 禽流感抗原 山西省兽医防治站提供。
1.3试验用动物 购自山东省家禽研究所的200日龄SPF产蛋鸡和20日龄SPF小鸡、太谷县某养鸡场200日龄非免疫产蛋鸡30只及健康小鼠10只。
1.4 免疫方法 SPF产蛋鸡肌注禽流感油乳剂灭活苗1mL，首免后7～10d再次用该苗2mL进行二免，二免后每隔3d用HI测定其卵黄效价，当卵黄效价达2E10以上即可收集鸡蛋，用于制备卵黄液。以后每隔一定时间强化免疫1次，保证卵黄效价。
1.5 卵黄液的制备 选择卵黄效价达2E10以上的高免蛋，分离蛋黄与灭菌蒸馏水按1∶1稀释，充分搅拌，保存备用。
1.6 1gY的纯化 制备好的卵黄液中加入相当与原卵黄体积8倍、4℃预冷的酸性蒸馏水，边加边搅拌，4℃保温静置过夜，取上清液，上清液用滤布过滤，过滤液进行超滤浓缩，浓缩倍数为4，所得超滤液中加入硫柳汞至终浓度为0.01%，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即为精制禽流感高免卵黄抗体。
1.7 抗体效价检测采用血凝抑制试验。
1.8 无菌检验 2.0mL精制禽流感高免卵黄抗体分别接种普通琼脂培养基、血液琼脂斜面和厌氧肉汤中，37℃培养48h，观察有无细菌生长。
1.9 安全试验 健康小鼠10只，每只皮下注射本品1mL；20日龄SPF小鸡10只，每只皮下注射本品5mL，观察2周。
1.10 动物试验 取200日龄非免疫产蛋鸡30只，随机分为3组，第1组为健康对照组，不注射任何药物，隔离饲养。第2和第3组每只鸡肌注、点眼、滴鼻接种EID50AIV种毒0.2mL。攻毒后24h分别给第2组鸡皮下注射本品2.0mL，第3组皮下注射生理盐水2.0mL。观察10d，记录每组鸡发病、死亡情况。
1.11 脱脂率与蛋白质回收率的测定用紫外分光光度计测定精制禽流感高免卵黄抗体在A280和A260处的吸光度，按紫外吸收差法测定蛋白质的含量，计算公式：蛋白质浓度（mg/mL）＝（1.45×A280－0.74×A260）。脂肪含量测定采用香草醛显色法。
1.12 保存期试验 将精制禽流感高免卵黄抗体分别保存在室温4℃和～20℃，每月测定一次HI效价。
2 结果
2.1 物理性状 应为无色或淡黄色液体，放置一段时间后瓶底有少量沉淀，pH值呈中性。
2.2 无菌检验 2.0mL精制禽流感高免卵黄抗体分别接种普通琼脂培养基、血液琼脂斜面和厌氧肉汤中，37～12培养48h，未见有任何细菌生长。
2.3 安全试验 健康小鼠10只，每只皮下注射本品2mL；20日龄SPF小鸡10只，每只皮下注射本品5mL，观察2周，未发现任何异常，精神状态和生长情况良好，证明精制禽流感高免卵黄抗体是安全可靠的。
2.4 动物试验 第1组健康状况良好，无发病死亡。第3组在攻毒后24～48h开始发病，出现死亡，72h全部发病，7d内死亡8只。第2组在注射精制禽流感高免卵黄抗体后12h即攻毒后36h有4只鸡发病，发病后12～24h，其中1只死亡，其余3只均恢复正常。证明该卵黄抗体确实起到了中和病毒的作用。
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